一種懸浮細(xì)胞KBM5高效基因編輯穩(wěn)定細(xì)胞系的建立方法

基本信息

申請?zhí)?/td> CN201910614553.9 申請日 -
公開（公告）號 CN110272875A 公開（公告）日 2019-09-24
申請公布號 CN110272875A 申請公布日 2019-09-24
分類號 C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90 分類 生物化學(xué)；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物學(xué)；酶學(xué)；突變或遺傳工程;
發(fā)明人 黃黎珍;鄒淑香;汪凱婷;鄒芬;陳瑩瑩;謝水林 申請（專利權(quán)）人 廣州華騰生物醫(yī)藥科技有限公司
代理機(jī)構(gòu) 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所（普通合伙） 代理人 廣州華騰生物醫(yī)藥科技有限公司
地址 510000 廣東省廣州市黃埔區(qū)廣州國際生物島螺旋四路1號辦公區(qū)第二層214-46單元
法律狀態(tài) -

摘要

摘要 本發(fā)明公開了一種懸浮細(xì)胞KBM5高效基因編輯穩(wěn)定細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建含靶向KBM5細(xì)胞基因的sgRNA的重組表達(dá)載體；(2)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞KBM5；(3)采用電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染法將步驟(1)獲得的重組表達(dá)載體和phCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染步驟(2)獲得的KBM5細(xì)胞；(4)篩選陽性細(xì)胞；(5)篩選單克隆細(xì)胞；(6)對單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定；(7)陽性單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存。本發(fā)明方法通過優(yōu)化的電轉(zhuǎn)染方案，可使轉(zhuǎn)染效率高于50％，能有效解決懸浮細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率低、病毒轉(zhuǎn)染有致突變性等問題，且具有操作簡便、成本低和基因敲除穩(wěn)定系的效率高等優(yōu)點(diǎn)。